可康医药

mRNA剪接是基因转录以及蛋白质翻译过程的关键一环，其中mRNA前体（pre-mRNA）的剪接是通过剪接体（spliceosome）实现的。剪接体是一种十分活跃的核糖核蛋白 “机器” ，在每个剪接循环中，剪接体都要经历四个连续的阶段：组装、活化、催化和拆卸。

在组装过程中，pre-mRNA被U1小核糖核糖核蛋白（U1 snRNP）识别，形成早期复合物（E）。早期复合物与U2 snRNP结合进一步形成前剪接体（A， pre-spliceosome），后者结合U4 / U6.U5 tri-snRNP形成前体剪接体（pre-B，precursor spliceosome）。

除了pre-B以外，剪接体还具有其它多达七个的主要功能状态：包括pre-catalytic spliceosome (B), activated spliceosome (Bact), catalytically activated spliceosome (B*), step I complex (C), step II activated complex (C*), post-catalytic complex (P) 以及intron lariat spliceosome (ILS).

在每个剪接循环中，相邻状态之间的剪接体重塑是由八个保守的ATPase 介导完成的，每个酶在pre-mRNA剪接中都起着不可或缺的作用。剪接反应包括两个步骤：分支化（branching）和外显子连接（exon ligation），分别在B *和C *复合体中完成。因此，branching过程严格受Bact-to-B *重塑的影响。

在该重塑过程中，Prp2酶与包含G-patch结构域的共激活因子Spp2一起，利用ATP结合和水解的能量将单链pre-mRNA的3'与5'末端进行连接，从而将Bact复合物向B *复合物状态进行转变。与Prp2相似，Prp43具有分解ILS复合体的功能，同时也需要共激活因子Ntr1的帮助。

对pre-mRNA剪接过程内在机制的理解离不开对其内部结构信息的揭示，尤其需要获得剪接体活性位点中心的结构以及ATPase /解旋酶的作用。自2015年以来，很多研究已经先后揭示了剪接体几乎所有主要功能状态下的超高分辨率冷冻电子显微镜结构。

然而，由于分辨率的限制，剪接体中的ATPase /解旋酶的源自结构仍未得到揭示，因此无法进一步获得pre-mRNA识别过程的信息。具体而言，目前仍然不清楚Prp2如何重塑Bact复合物以及Prp2为什么需要其共激活因子Spp2来完成这一过程。

为了解决这些关键问题，来自西湖大学的施一公教授团队首次揭示了啤酒酵母中该完整复合物的冷冻电镜结构，分辨率达到2.5Å（是目前完整剪接体的最高分辨率），从而可以在原子层面鉴定12种新蛋白质，包括Prp2和Spp2。结构以及生化分析阐明了Spp2激活Prp2的机制。

随后，研究者们进行了第二轮的结构研究，主要针对三个不同功能状态的Prp2：自由Prp2、结合Spp2的Prp2和ADP-Spp2-Prp2复合体，这些结构帮助阐明Prp2重塑Bact复合体的作用机制。

啤酒酵母菌Bact复合体包含50种蛋白质、三个snRNA和一个pre-mRNA，分子量为1.86M Da。Bact复合体包含U2 snRNP、U5 snRNP、U6 snRNA、NTC、NTR、RES复合体和七个剪接因子，其中包括Prp2及其共激活因子Spp2。与Bact复合体的已公开结构相比，该研究揭示的模型具有12种新蛋白质（包括Spp2、Prp9、Prp21、 U2 Sm ring、Lea1和Msl1）。

（酿酒酵母Bact复合体结构）

该模型还包括1598个新氨基酸和另外193个核苷酸分子。Bact复合体中存在1716个水分子，这些水分子对于介导各个蛋白之间的相互作用十分重要。作者重点观察了Bact复合体中的Prp2结构，Prp2结构域包括6个结构域、N末端柔性延伸区（1-222氨基酸残基）、RecA1（223-403氨基酸残基）、RecA2（404-579氨基酸残基）、WH （氨基酸残基580-647）、HB（氨基酸残基648-784）和OB（氨基酸残基785-876）。其中，C端的三个结构域包括WH、 HB以及OB，它们彼此紧密作用以形成刚性的球状单元，N端的RecA1以及RecA2对于其ATPase活性具有重要的作用。

N端外围延伸的去除并不会影响Prp2的ATP水解或mRNA剪切活性，然而该延伸能够与Prp45交联，暗示其对于Prp2向剪接体募集具有一定作用。与刚性的C端不同，N端RecA1以及RecA2之间具有相对的柔性，C端与N端之间形成的通道用于RNA的结合，该通道可容纳8个核苷酸。

（Prp2与Bact复合体精细结构）

通过与Brr2, Rse1以及Spp2结合，Prp2与从而能够募集到Bact复合体中。此外，Prp2中的OB结构域对于其与Rse1结合至关重要。与其它蛋白-蛋白相互作用相比，Prp2与Hsh155或Rse1之间的相互作用密度非常低，这表明Prp2与Bact复合体之间的互作非常脆弱。然而，值得注意的是，这种弱相互作用被共激活因子Spp2大大增强。

之后，作者揭示了Prp2与pre-mRNA相互识别的内在机制。作为具有DEAH-box结构域的 ATP酶，Prp2结合并转移到pre-mRNA单链内含子区域的3'至5'处，以触发第一步催化的蛋白质重排。在新解析的结构中，pre-mRNA的八个连续核苷酸（分别称为U1至U8）被分为三组，每组在Prp2的RNA结合通道中显示出不同的构象。组1包括U1和U2，它们的核碱基彼此相互作用，并被Phe816，Pro811和His810的侧链推离其碱基堆积位置。

第2组仅具有单个核苷酸U3，它的核碱基独立存在，与U2的核碱基相距10Å，而与U4的核碱基相距5Å以上。U3核碱基的独立构象由Arg844的胍基通过阳离子-π相互作用保持稳定。

第3组包含五个连续的核苷酸U4-U8，与U3形成鲜明对比的是，U4到U8的核碱基彼此紧密堆积。Leu536的脂肪侧链同时与U3的核糖和U4的核碱基相互作用，将U3推离U4并阻止U4向后向5'端滑动。

（Prp2结合pre-mRNA的结构机制）

作者还揭示了Spp2帮助Prp2与Bact复合体稳定结合的机制。Spp2包含185个氨基酸，具有一定的柔性特征。在Bact复合体中，Spp2同时与Prp2和剪接体中的Rse1和Brr2相互作用。这些相互作用涉及四个单独的接口，每个接口都包含Spp2的离散序列片段。接口I和II占据Spp2的N末端一半，包含两个短序列基序：氨基酸残基2-14和氨基酸残基50-58。它们分别锚定在Rse1和Brr2上。

接口III和IV在Spp2的C末端一半，包含两个序列基序：氨基酸残基69-116和氨基酸残基141-151，它们都锚定在Prp2上，这四个接口预计将显著增强Prp2与剪接体的关联。

在间接复合体中，Spp2的任意两个相邻序列基序之间的插入序列高度灵活且无序，该结果揭示了Spp2将Prp2绑定到Bact复合体中的结构信息。

（SPP2与Srp2以及剪接体相互作用的结构机制）

研究通过揭示Prp2和Spp2的高分辨率原子结构（单独以及与Bact复合体结合），为剪接循环的必需ATP酶 /解旋酶的工作机制提供了信息，这填补了剪接体主要功能状态的先前结构表征中的重要空白。

无独有偶，在同期的《Science》文章中，来自德国马普研究所的Reinhard Lührmann教授团队发表了高分辨率的人源pre-Bact复合体的电镜结构（3.9-4.2 Å.）。这些结构阐明了激活过程中发生的众多蛋白质交换的顺序，相互排斥的相互作用（确保形成U2 / U6催化RNA所需的核糖核蛋白重排正确顺序）以及逐步折叠的途径。通过与成熟的Bact复合体的结构进行比较，揭示了支架蛋白PRP8的构象变化促进U2 / U6催化RNA的最终3D折叠的内在分子机制。

参考文献：

1. Mechanism of spliceosome remodeling by the ATPase/helicase Prp2 and its coactivator Spp2. Science 08 Jan 2021: eabe8863. DOI: 10.1126/science. abe8863

https://science.sciencemag.org/content/early/2020/11/24/science.abe8863/tab-pdf

2. Mechanism of protein-guided folding of the active site U2/U6 RNA during spliceosome activation. Science 26 Nov 2020: eabc3753. DOI: 10.1126/science.abc3753

https://science.sciencemag.org/content/early/2020/11/24/science.abc3753